TitleAngiopoietin-1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的研究
Authors孙丽杰
Affiliation北京大学
Keywords间充质干细胞
细胞移植治疗
血管生成素
基因治疗
急性心肌梗死
心功能
Issue Date 1
Citation北京大学.
Abstract目的:骨髓间充质干细胞(MSC)具有自我更新和多向分化潜能,是急性心肌梗死细胞移植治疗的理想细胞。血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang1)是内皮细胞特异性的生长因子,能够促进血管生成。本研究尝试用Ang1修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死,以了解其细胞再生,促进血管生成,减小梗死面积,改善左室重构的作用,从而达到改善心功能的目的。 方法:全骨髓贴壁培养法分离培养原代Lewis大鼠骨髓MSC。利用AdMax系统包装腺病毒载体,获得携载绿色荧光蛋白的空载腺病毒(AdGFP)和重组人Ang1的腺病毒(AdAng1)。以MOI﹦300转染骨髓间充质干细胞,通过绘制MTT曲线了解腺病毒转染对MSC增殖活力的影响。对获得的转染AdAng1、和转染AdGFP的骨髓MSC细胞(MSCAng1细胞,和MSCGFP细胞)采用RT-PCR,Western Blot,细胞免疫荧光的方法检测人Ang1在mRNA和蛋白水平的特异性表达,并采用real time PCR和ELISA的方法检测人Ang1的动态表达情况。通过结扎Lewis大鼠前降支的方法制备急性前壁心肌梗死模型。将转染后36小时的5×106个MSCAng1细胞,或MSCGFP细胞采用心肌内注射的方法移植入大鼠梗死心肌周围(分别为MSCAng1组,和MSCGFP组),并设立心梗后注射PBS组作为空白对照。用荧光显微镜观察移植后1,3,7,28天MSCAng1的GFP表达。术后7,28天采用RT-PCR和ELISA的方法检测人Ang1基因和蛋白水平的表达,采用免疫组化的方法进行组织学检测Ⅷ因子代表的血管生成和α-SMA代表的肌性小动脉形成,并采用Masson染色的方法检测心梗面积及其室壁厚度率代表的心肌重构等。术后3,7,14,28天超声心动检测梗死心脏功能和结构的改变。 结果:(1)体外实验:全骨髓培养法所得骨髓间充质干细胞增殖迅速。以MOI=300为感染复数进行的AdAng1,AdGFP转染第三代骨髓MSC,可以达到72﹪的转染效率,并对MSC的增殖活力不产生影响。MSCAng1细胞可以在mRNA水平和蛋白水平高效表达人Ang1,并分泌到细胞培养上清中,表达可持续至18天,其中转染后7天内呈现高浓度水平的表达。(2)体内实验: MSCAng1细胞在大鼠梗死心肌内能够存活并表达GFP,并且在移植后7天内表达Ang1,28天消失。移植后7天,28天MSCAng1组、MSCGFP组与PBS组相比,血管生成及肌性小动脉生成增加,梗死面积减少,心室内径扩大的程度减小,心功能改善(P<0.05)。而MSCAng1组比MSCGFP组,血管密度增加11-35%,梗死面积减少30%,梗死室壁厚度增加46%(P<0.05),心功能在7天有所改善(P<0.05),在28天无显著性差异。 结论:腺病毒载体能够有效地将Ang1基因转入MSC,获得的MSCAng1细胞能够表达分泌较高浓度的Ang1蛋白。MSCAng1能够在急性心肌梗死大鼠心肌组织内存活并且在一定的时间段内表达外源Ang1蛋白。急性心肌梗死时,MSCAng1细胞比MSCGFP细胞有更强的促进血管生成的作用,并能够进一步减小梗死面积,增加室壁厚度,改善心肌重构,但心功能的改善并不明显。
URIhttp://hdl.handle.net/20.500.11897/205869
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