TitleDNA及核酸酶通用指示探针系统的构建与应用
Authors李晓敏
Affiliation北京大学
Keywords通用分子信标
实时荧光PCR
DNA聚合酶
DNA点突变
核酸酶分析
Issue Date2008
Citation北京大学.
Abstract在分子水平上研究核酸、蛋白质及相互作用和开发简便、准确、价廉的临床样品核酸检测方法是生命分析科学的重要研究内容。分子信标与实时PCR技术的结合积极推动了研究核酸与蛋白质问相互作用的研究过程。但在实际应用中,不论是针对基因研究,还是针对核酸酶的活性分析,探针都是目标序列特异性的,对于不同体系都要重新设计序列,导致实际应用中操作繁琐,普及性不高。本论文建立一种通用的检测系统,将实时荧光PCR技术和通用分子信标相结合,通过巧妙的设计可以使不同的核酸及核酸酶分析体系都能采用相同的探针,这不仅避免了新探针设计和反应条件优化的繁琐工作,而且大大降低了检测费用,适合临床检测。本论文研究内容主要分为以下几个方面: 一、通用型分子信标实时荧光PCR示踪系统的建立、优化及应用于临床样品DNA点突变检测。该示踪体系有两种模型:一种用于DNA检测,另一种适用于核酸酶的动力学实时分析。该分析系统主要由通用分子信标、引物和DNA聚合酶组成,利用实时荧光PCR技术检测。质粒体系点突变验证了该系统原理的可行性,并在此基础上发展到临床检测,通过对18个临床乳腺癌样品的统计分析,可以快速、灵敏、方便而准确地检测乳腺癌p53基因外显子7中第259密码子的G→A点突变。 二、通用型分子信标实时荧光PCR示踪系统在乙肝病毒DNA中的应用研究及探讨该体系中引物设计的问题。通用模型体系不仅可以进行点突变检测,DNA聚合酶识别差异分析,同时可以用同样的分子信标探针检测乙肝病毒DNA。通过对临床90个血清样品分析,该体系能够准确的检测出血清中病毒DNA水平,定量检测HBVDNA的范围达5个数量级,而且具有良好的重现性,适合于不同病毒变异体检测。相对常规实时荧光PCR体系,通用信标实时荧光PCR示踪体系更换检测对象时只需要设计、优化引物,不需要重新优化浓度,不需要重新设计、优化荧光探针,检测步骤简便,适合临床推广应用。该体系由于热循环设计中有25℃降温,而且带尾巴引物序列比较长,会出现杂交情况导致假阳性现象产生,所以要对引物进行优化。 三、通用型分子信标实时荧光PCR;模型2应用于限制性内切酶动力学过程研究。利用通用模型实时地研究限制性内切酶平末端AIuI和粘末端EcoRI的动力学活性,并获取限制性内切酶Km和Vmax动力学参数。对限制性内切酶的浓度检测达到0.002U/μL,分析线性范围达2个数量级,底物分析浓度达到纳摩尔级,建立了快速、灵敏、准确的限制性内切酶活性分析方法。与已有的研究相比,该方法将酶切和检测过程相对独立开来,实现了高通量、自动化的分析检测,同时为其它核酸酶的研究提供了分析平台。 四、高特异性的DNA聚合酶对碱基匹配错配识别差异的分析体系,利用单循环等位基因特异性扩增,在最大程度上体现匹配错配等位基因特异性扩增的差异性,准确性高。利用该体系进行了12个临床乳腺癌样品分析,准确地检测了乳腺癌p53基因外显子7中第259密码子的G→A点突变。对DNA聚合酶Klenow大片段3’校正活性分析,可以较好的区分不同匹配错配的延伸差异,其中G:C,C:G匹配体系反应最快,G:T,T:G,A:A错配体系最慢,其它的速率中等。该体系可为理论上研究DNA聚合酶校正催化效率提供有效研究手段。 本论文研究工作将发展分析化学新方法和新体系同解决生命科学问题及临床检测的需求紧密结合,创造性地利用实时荧光PCR技术结合分子信标探针构建了通用型的核酸及核酸酶活性的检测系统,并应用于临床基因点突变、病毒DNA、限制性内切活性和DNA聚合酶活性的实时研究,为这一生命科学关注的热点领域发展了一个新的研究思路和有力的分析手段。
URIhttp://hdl.handle.net/20.500.11897/362195
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