致龋变形链球菌6-磷酸葡糖胺脱氨酶与合成酶的结构与功能研究

Abstract

6.磷酸葡糖胺脱氨酶(NagB)(EC3.5.99.6)与6-磷酸葡糖胺合成酶(GlmS)(EC2.6.1.16)是催化6-磷酸葡糖胺(GIcN6P)和6-磷酸果糖(F6P)之间相互转化的两个在糖胺代谢中起重要作用的酶，其中NagB的功能是催化6-磷酸葡糖胺通过脱氨和异构两步反应生成6-磷酸果糖，NagB对于N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是否被利用最终进入糖酵解途径起关键作用，而GlmS则催化逆反应由6-磷酸果糖生成6-磷酸葡糖胺，这一步反应是己糖生物合成途径的第一步反应，也是限速反应。这条通路的终产物UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)在真菌中生成壳质(chitin)，在细菌中生成肽聚糖(peptidoglycan)，是参与细胞壁合成的重要组成部分。，在没有外源的葡糖胺或者N-乙酰葡糖胺的情况下，大肠杆菌和真菌中GlmS的缺陷型都是致死的，所以GlmS被作为潜在的抗菌药物靶标，而针对GlmS抑制剂的筛选也在国外的一些实验室进行中。本论文中研究的NagB与GlmS来源于属于革兰氏阳性菌的致龋变形链球菌(Streptococcusmutans，Smu)，此菌是最主要的龋齿致病菌之一。因此针对致龋变形链球菌的重要毒力因子和影响细菌生长代谢的相关蛋白质结构与功能的研究能够为防治龋病的药物设计提供理论基础和实验支持。 本论文工作运用X射线衍射技术分别测定了SmuNagB的天然蛋白以及蛋白与底物(GlcN6P)结合的复合体的三维空间结构。基于以下四个方面通过实验和分析得到的数据(1)SmuNagB(天然蛋白及底物复合物)与同家族的其他结构已知蛋白质的结构与动力学特性的比较分析；(2)SmuNagB天然蛋白及突变体酶促反应动力学参数的测定与比较；(3)对本家族已知结构的蛋白质晶体的结晶条件中pH值的详细比较和分析；(4)对于SmuNagB天然蛋白酶活性随pH值变化的变化趋势的测定；第一次提出了在隶属单体家族(monomericsubfamily)的NagB的蛋白质结构中，在底物结合的过程中起重要作用的盖子区(lid区)在结合底物过程中需要经过比较大的空间构象变化，相应的整个lid区的动力学特征由结合底物前的局部自由度(nexibility)很大到结合底物后的自由度显著降低。第一次在本家族中观察到反应物和酶起始状态(E-Scomplex)的复合物，为之前长期的猜测和推断提供了最直观的结构上的证据。通过复合物结构分析确定了几个新发现的参与反应物结合的在NagB家族中高度保守的重要氨基酸，并得到了突变体酶活数据的验证。提出了涉及开环反应的基于结构的酶促反应机理，同样得到了突变体酶活数据结果的支持。通过酶活实验确定SmuNagB为pH值依赖型的6-磷酸葡糖胺脱氨酶，并通过对比分析本家族已知结构的蛋白质晶体结晶条件阐明我们能够获得反应物和酶起始状态复合物的原因，而后三点又可以相互印证使整个结论更加真实可靠。通过对SmuNagB的结构生物学研究，扩展和深化了对整个NagB家族涉及酶促反应的多方面的理解和认识。 运用X射线衍射技术测定了SmuGlmS的异构结构域(ISOM)的天然蛋白及分别结合底物和产物的复合物的三维结构。通过对SmuGlmS的ISOM结构与同家族其他已知结构的比较分析，借鉴研究SmuNagB的经验和结论，对比分析SmuGlmS的ISOM及同源蛋白中已知结构的蛋白晶体各自的结晶条件，首次提出在开环涉及的关键氨基酸组氨酸附近的谷氨酸和天冬氨酸在催化中的作用，通过本家族同源蛋白的序列比对表明这三个氨基酸在整个家族中高度保守。进而提出GImS家族酶由组氨酸，谷氨酸和天冬氨酸共同参与完成的开环机理假说(machanismofring-openning)，对EcoGlmS以及SmuGlmS的ISOM在不同pH值的结晶条件下组氨酸活性状态变化的分析得出的结论，为我们提出的GImS家族的涉及开环的酶催化反应的分子机制提供了有力的实验证据支持。通过对底物(产物)结合复合物的结构分析验证了通过EcoGlmS的复合物结构确定的ISOM活性中心参与底物结合的关键氨基酸的类型和与底物(产物)的结合位点。 另外，本论文还运用实验室建立的高通量基因克隆，表达平台及X射线衍射技术和不同的酶活性测定方法研究了变形链球菌色氨酸合成路径中涉及到的四个蛋白酶，分别为：邻氨基苯甲酸合成酶(SmuAS复合物)，磷氨基苯甲酸核糖转移酶(SmuTrpD)，吲哚甘油磷酸合成酶(SmuTrpF)和5’-磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(SmuTrpC)。其中解析完成了SmuTrpC结构，测定了SmuAS复合物和SmuTrpD的酶促反应活性特征，结构解析及功能分析正在进行当中。